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支原體常規檢測方法匯總(三)
點擊次數:17 發布時間:2021-11-25

細胞培養過程中支原體檢測方法如約而至

第三期來啦!

還沒有看前兩期內容的小夥伴

可以看我之前發的:支原體常規檢測方法匯總(一)、支原體常規檢測方法匯總(二)

上回書和上上回書說道

qPCR檢測法是一種目前比較常用

效果也比較可靠的方法

那除了qPCR

還有沒有其他方法可以檢測呢?


所以今天就來講講

分離培養法和DNA染色法

有請兩位主角閃亮登場

01、分離培養法

簡單來說,這種方法的基本原理就是:分離,然後培養

聽君一席話如聽一席話,展開來講,就是從可疑的細胞培養體係中取樣,接種到適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體,它們就會在這種瓊脂平板上快速生長,最終形成明顯可見的特征性菌落。

操作規範的情況下,這種方法很少會出現假陰性結果,檢測精確度很高,因此被譽為支原體檢測金標準。

缺點就是檢測時間太長,支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。另一方麵,盡管可以檢測絕大多數支原體種類,分離培養法也有力所不及的時候,例如支原體M. Hyorhinis。因此,該方法能鑒定的支原體種類有限,成為它的另一個缺點。

02、DNA染色法

該方法的實驗思路是:培養指示細胞、樣品上清液收集、上清液接種、染色觀察結果

這一波操作看起來有點複雜,那展開說說:

將供試品接種於指示細胞(無汙染的Vero 細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞,供試品應對該細胞生長無影響。下麵以Vero細胞為例)中培養後,用特異熒光染料(如Hoechst 33258)染色,支原體中的核酸也可以被著色,因此,如果待檢測細胞中含有支原體,那麽就會導致指示細胞被感染,進而在細胞膜或培養基等處發現藍色熒光(支原體附著在細胞膜上,也有可能遊離在細胞培養基中)。

指示細胞培養:將指示細胞複蘇、傳代,調整至最佳狀態,留出適宜的量備用。

樣品上清液收集:無抗生素培養基中加入待檢測樣品後,細胞需至少傳一代,然後取細胞已長滿且3 天未換液的細胞培養上清液待檢。(為了對待檢測樣品中的支原體進行富集)

上清液接種:在製備好的指示細胞培養板中加入一定量的待檢細胞培養上清,36°C培養3-5 天。指示細胞培養物至少傳代1 次,末次傳代培養可用6孔板培養3-5 天。

染色觀察:吸出培養孔中的培養液,加入固定液,放置5分鍾。吸出固定液後進行10min的二次固定,再次吸出固定液,使蓋玻片在空氣中幹燥。加DNA 染料工作液5ml,加蓋,室溫放置30分鍾,漂洗3次,幹燥,封片。用熒光顯微鏡觀察。

熒光顯微鏡下可見細胞表麵或培養基中,有大小不等、不規則的藍色熒光著色顆粒,則說明有可能存在支原體汙染。

對於DNA染色法方法,優缺點也是很明顯的:

優點:

1、適用於一些不易培養的支原體,如豬鼻支原體,分離培養法對該支原體檢測並不可靠,但可用DNA染色法準確地檢測出來。

2、操作步驟雖然多,但都相對簡單

3、靈敏度尚可。

缺點:

1、時間較長,從Vero細胞複蘇、傳代,再到收集上清後再次培養,有時甚至需要十幾天時間

2、存在假陽性和假陰性的可能:如一些死亡細胞釋放出來的DNA會被染成藍色,出現假陽性;或是由於熒光過若而出現假陰性使結果出現偏差,因此使用這個方法需要一定的經驗。


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