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支原体常规检测方法汇总~之二
点击次数:30 发布时间:2021-11-24

上周丝瓜草莓向日葵一起讨论了基于Venor®Gem qEP试剂盒的支原体qPCR经典检测法,也是目前使用比较广泛的方法之一。

当然啦,关于支原体的检测,方法众多。今天丝瓜草莓视频下载就来了解一下,操作相对更简单的“一步法"。该方法会用到Minerva Biolabs公司的另一种试剂盒——VenorGeM® OneStep,它与上周介绍的经典法试剂盒类似,都是利用了荧光定量PCR的基本原理。

(前情提要在这里,戳戳下方图片传送到经典法支原体检测试剂盒详解)

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不同的是,“一步法"试剂盒中,直接将内控添加到预混液中,使用起来更加方便、节省时间。

下面丝瓜草莓视频下载就来详细介绍一下VenorGeM® OneStep支原体检测试剂盒。👇

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使用方法

步骤

与经典法大致相同:

样品处理➡试剂制备➡体系建立➡启动PCR反应➡结果判定

样品处理:

取100μl左右的细胞上清液

95℃孵育后离心,取适量用于后续qPCR。

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细胞培养样品易含丰富的DNA酶,在低温下也能降解支原体DNA。因而推荐进行样品稳定化处理。

试剂制备:

将缓冲液、预混液、阳性对照等试剂按照说明书要求,该离心的离心、该混合的混合,处理好后扣紧盖子备用。

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PCR体系建立:

在PCR管中,根据需要,加入样品、阳性对照、新鲜培养基(阴性对照),并且设置好重复孔,盖好盖子,震荡混匀。

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启动PCR反应:

按照所需参数,设置好PCR仪,启动程序(具体参数详见产品使用说明或是缔一生物网站,点击下方阅读原文即可)。

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FAM通道:检测支原体荧光信号。

HEX通道:检测内控对照荧光信号

支原体DNA和内控DNA,存在信号之间的竞争性抑制

支原体DNA越多,FAM通道信号越高

检测内控对照的HEX信号通道信号越低。

定量需要基于Ct值和DNA标准曲线

Ct<40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。

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小结:

总的来说,一步法试剂盒是经典版试剂盒的升级版

在以下几个方面都是相同的:

①都具有高特异性:一次即可涵盖所有常见易感染细胞的支原体物种(包括欧洲药典规定的9种支原体)。与细菌和真核DNA无交叉反应。

②都具有高灵敏度:最高检测限可达到10CFU/ml。

③都具有相应配套的支原体基因组DNA和细菌基因组DNA,便于特异性验证。

④都有相应配套的支原体绝对定量标准品,便于最后定量检测。

不同之处在于,一步法试剂盒省去了配置内控对照的环节,为实验人员节省了宝贵时间,但相应的,价格也会比经典法试剂盒高出一部分。



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